导言#
胃癌，其中胃腺癌（GAC）是其主要组织学类型，是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一。相当一部分胃癌患者在晚期被诊断，这在很大程度上限制了治疗的有效性和患者的预后。尽管手术切除仍然是治疗的强制性支柱，包括 JCOG9501 和 JCOG9502（日本临床肿瘤研究组的系列研究）在内的几项研究表明，胃癌患者不会从扩大切除中受益。在过去的十年中，新辅助和围手术期治疗带来了新的希望。MAGIC 试验表明，对于可切除的 II/III 期胃癌患者，行三个术前和三个术后周期的 ECF（表阿霉素、顺铂和 5 - 氟尿嘧啶）化疗，相较于仅手术，可以将 5 年生存率从 23% 提高到 36%（MAGIC: the Medical Research Council Adjuvant Gastric Infusional Chemotherapy）。FLOT4-AIO 试验进一步显示，与 ECF 或 ECX（表阿霉素、5 - 氟尿嘧啶和卡培他滨）相比，FLOT（5 - 氟尿嘧啶、叶酸、奥沙利铂和多西紫杉醇）方案可导致更好的病理反应率、R0 切除率和总生存（OS）。人们认识到，术前用化疗治疗可以增加根治切除的机会，消除早期微观扩散，并允许对辅助治疗进行术前反应评估。随着免疫检查点抑制剂（ICIs）等新药物的出现，化疗仍然是胃癌围手术期治疗中最基本且可获得的组成部分。
另一方面，在胃癌中，术前治疗仍然存在争议，尤其是在东亚国家。对术前化疗的反应存在异质性，而对其机制的了解有限。需要预测患者对术前化疗反应的生物标志物，以对患者进行最佳治疗分层。新出现的证据表明，免疫参与了患者对化疗的反应。Choi 等人报道称，肿瘤标本中基质程序性细胞死亡配体 1（PD-L1）的表达可以预测第 II/III 期胃癌经 D2 胃切除术后辅助化疗的益处。 Kim 等人在标准一线化疗期间使用配对的术前和治疗期间的胃活检样本，发现化疗诱导了自然杀伤细胞（NK）的浸润，巨噬细胞的极化，以及在治疗反应者中抗原呈递的增加。但是，在胃癌免疫学领域的现有研究主要集中在肿瘤微环境（TME）中的局部免疫反应上，关于全身免疫与胃癌化疗反应之间的关系知之甚少。
胃癌是一种全身性疾病。肿瘤负担和抗肿瘤治疗刺激的免疫反应在不同组织之间协调进行。对接受术前化疗的患者进行系统免疫景观或由 Hiam-Galvez 等人描述的免疫宏环境的分析对于全面了解癌症免疫和治疗抵抗机制至关重要。现有的系统免疫 - 炎症指标，如中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR），主要依赖于血细胞计数，这限制了它们的维度。血清免疫蛋白质组学，具有高含量，将是对全身性免疫的理想反映。在这项研究中，我们收集了胃腺癌患者在术前、术中和术后接受术前化疗的血清样本，并使用基于抗体的蛋白质组学平台（Olink Target 96 Inflammation panel）研究了他们的免疫蛋白质组学。我们还从这些患者中收集了手术切除的肿瘤样本，并结合多重免疫荧光（mIF）、免疫组织化学（IHC）和 RNA 测序（RNA-seq）来评估肿瘤微环境。研究了血清免疫蛋白质组学的动态变化及其与肿瘤微环境的相关性。鉴定了预测接受术前化疗患者肿瘤缩小、总生存（OS）和无进展生存（PFS）的生物标志物。
结果#
研究人群#
本研究纳入了 90 名接受术前化疗并随后接受胃切除手术的胃腺癌患者（图 1A）。在术前期间接受免疫检查点抑制剂（ICIs）的患者被排除在外。符合条件的患者被分为响应者（残余肿瘤 / 肿瘤床≤50% 的化疗效果，Becker TRG 评分 1–2）和非响应者（Becker TRG 评分 3）。在 90 名患者中，有 36 人（40%）达到了肿瘤缩小评分 1–2，被视为响应者。肿瘤缩小程度较好的患者与非响应者相比，总生存显著更长（图 S1A）。无进展生存显示了类似的趋势，尽管没有统计学差异（图 S1B）。患者的基本临床特征总结在表 S1 中。近半数的患者接受了两药细胞毒性化疗，其中大多数是 SOX（S-1 加奥沙利铂）或 XELOX（卡培他滨加奥沙利铂）方案。其余的患者接受了三药细胞毒性化疗，主要是 DOS（多西紫杉醇、奥沙利铂和 S-1）方案。截至 2022 年 3 月 1 日的分析日期，中位随访时间为 55.8 个月（范围从 3.2 到 82.7 个月）。在整体人群中，中位无进展生存为 39.8 个月（95% 置信区间 [CI]，32.7 至未达到 [NR]），而中位总生存为 63.9 个月（95% CI，51.8 至 74.1），有 45 例死亡（50%）。
血清免疫蛋白质组学动态与术前化疗反应相关#
从接受术前化疗的患者中收集了 37 份术前、8 份术中和 83 份术后的血清样本，其中 30 份术前和 30 份术后的血清样本是成对的（图 1A）。使用 Olink Target 96 Inflammation panel 的近距离扩展测定法（PEA）测量了关键免疫和炎症通路中 92 个标记蛋白的水平。比较术前和术后血清样本中蛋白质水平显示了术前化疗后血清免疫蛋白质组学的动态变化。92 个蛋白中有 18 个在成对和非成对测试中均显示出显著变化（图 1B、图 S1C 和图 S1D），表明术前化疗引发了复杂的全身免疫反应。其中，血清 C-X-C 基序化学因子配体 1（CXCL1）和 CXCL5 水平在术前化疗后显著下降（图 S1D）。有趣的是，Zhou 等人报道称，作为 CXCR2 配体的 CXCL1 和 CXCL5 可以显著促进胃癌细胞的迁移，并推动胃癌的转移。化疗通过降低 CXCL5 和 CXCL1 的血清水平可能有助于预防胃癌的转移。事实上，CXCL1/5 水平在术前化疗的早期周期中下降（图 S1E）。
我们进一步比较了不同治疗反应患者的血清免疫蛋白质组学动态变化。我们发现，响应者在治疗后表现出更动态的血清免疫蛋白质组学变化（图 1C 和 1D）。我们还比较了化疗后响应者和非响应者蛋白水平的绝对变化，发现在响应者中，免疫蛋白水平在化疗后整体上更大幅度的变化（图 1E）。例如，与响应者相比，非响应者治疗后血清 CXCL5 水平的降低程度要轻得多（图 1C–1F）。在治疗期间的蛋白质组学在响应者和非响应者中也似乎存在差异（图 S1E）。例如，在响应者中，治疗期间血清白介素受体亚单位 b（IL-10RB）和 IL-18 水平在化疗过程中呈上升趋势，而在非响应者中未呈现这种趋势（图 S1F 和图 S1G），尽管这一部分的结论可能受到样本数量的限制。
综合而言，这些结果表明在胃腺癌患者中对术前化疗存在复杂的全身性免疫反应。响应者在术前化疗后往往表现出更为动态的全身性免疫反应。
肿瘤微环境（TME）与患者对术前化疗的反应相关#
首先，我们比较了来自不同治疗反应患者的肿瘤样本的转录组，以获得有关肿瘤局部特征的一般知识。基因集富集分析（GSEA）显示了良好反应者中改变的标志性通路（图 2A）。如 DNA 复制和细胞周期等通路的改变，可能表明抑制癌细胞增殖和肿瘤退化。除此之外，近一半的通路与免疫有关，如趋化因子信号通路和细胞因子与细胞因子受体相互作用通路（图 2B 和图 2C），表明免疫在化疗中的重要性。
因此，我们通过多重免疫荧光（mIF）在手术切除的肿瘤样本中评估了地理免疫景观。我们使用 CD4、CD8 和 Foxp3 染色来识别不同类型的 T 细胞。我们使用 CD68 和 CD163 染色来识别巨噬细胞（图 2D）。我们比较了响应者和非响应者之间的免疫浸润。CD68 + 巨噬细胞和 CD68+/CD163+ M2 巨噬细胞的细胞密度在非响应者中显著更高（图 2E 和图 S2A）。相应地，Xing 等人报道称，在胃癌新辅助化疗后，非响应者中 CD68 + 巨噬细胞浸润更高。M2 巨噬细胞也被证明参与了多种癌症的化疗耐药。
与此同时，我们从队列中收集了 24 份术前内镜活检样本。我们使用 mIF 对术前 TME 进行了分析（图 S2B）。值得注意的是，大多数内镜活检只获取了胃的表浅黏膜，这在很大程度上限制了它们对整个肿瘤的代表性和与手术切除组织的可比性（图 S2C）。事实上，mIF 显示术前 TME 中的免疫细胞浸润在响应者和非响应者之间没有差异（修订后的图 S2D），这可能是由于活检深度有限和胃癌内肿瘤的显著异质性。
总体而言，这些结果表明术后 TME 与对术前化疗的反应相关。
血清免疫蛋白质组学与 TME 之间的相关性#
鉴于大多数现有的癌症免疫学研究集中在肿瘤微环境（TME）上，我们评估了全身免疫与 TME 之间的相关性。我们还确定了血清免疫蛋白质组学与 TME 中免疫细胞浸润之间的相关性。有趣的是，术后 TME 似乎与术前而非术后血清免疫蛋白质组学更相关。即使在样本数量较少的情况下，术前血清免疫蛋白质组学与免疫细胞浸润之间的相关性总体上更强（图 3A 和图 3B）。例如，更高的术前血清纤维母细胞生长因子 21（FGF21）水平与 CD68 + 巨噬细胞的浸润较少呈相关，而更高的术前血清转化生长因子 b1（TGF-b1）水平与 CD4+T 细胞的浸润较多呈相关（图 3C 和图 3D）。事实上，据报道 TGF-b 在调节效应器和调节性 CD4 阳性细胞反应方面具有多效性。 术后血清免疫蛋白质组学与术后免疫细胞浸润之间的相关性也被观察到。例如，更高的术前血清 C-C 基序化学因子配体 11（CCL11）水平与 CD4+/FOXP3+ T 细胞的浸润较多呈相关（图 3E）。王等人报道 CCL11 增加了乳腺癌中 CD4+CD25+Foxp3 + 调节性 T 细胞（Tregs）的比例。需要进一步的研究来探讨 CCL11 是否在胃癌中调节 CD4+Foxp3+Treg 细胞功能。
我们还评估了术后血清蛋白水平与 92 个免疫基因的肿瘤 mRNA 水平之间的相关性。其中有 5 个免疫基因的相关性具有统计学意义，仅有两个是正相关的，符合预期（图 3F 和图 S3A–S3E）。TNFSF12 和 CCL4 的相关性实际上是边缘的（图 S3A 和图 S3B）。血清蛋白水平与组织基因 mRNA 水平之间的相关性总体上较弱。
这些结果显示了全身性免疫与肿瘤微环境之间的相互通信和相互依赖关系。对肿瘤微环境的研究无法充分揭示免疫系统如何全面应对胃癌和抗肿瘤治疗。应该投入更多的努力来对患有胃癌的患者进行系统性免疫分析。
经典全身性免疫炎症指标的临床价值#
经典全身性免疫炎症指标大多基于血细胞比率，并已证明与患者的临床结局相关。 我们对血清免疫蛋白质组学与经典全身性免疫炎症指标之间的关系感到好奇。因此，我们评估了术后血清免疫蛋白质组学与经典免疫炎症指标之间的相关性，包括中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、血小板与淋巴细胞比值（PLR）、单核细胞与淋巴细胞比值（MLR）以及血小板分布宽度（PDW）以及常见血细胞计数。尽管大多数相关性相对较弱（图 S3F），但血清 CXCL5 和 CXCL1 水平与血小板计数呈强相关（图 S3G 和图 S3H）。由于 CXCL1 和 CXCL5 通常参与中性粒细胞的稳态和功能，需要更多的工作来理解这种意外但有趣的相关性。我们还评估了经典全身性免疫炎症指标与 TME 特征之间的关系。术后经典免疫炎症指标与 TME 中的免疫细胞浸润之间没有观察到相关性（图 S3I）。
我们进一步探讨了经典全身性免疫炎症指标的临床价值，并评估了中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、血小板与淋巴细胞比值（PLR）、单核细胞与淋巴细胞比值（MLR）和血小板分布宽度（PDW）的治疗响应预测价值。我们绘制了这四个指标的受试者工作特征（ROC）曲线，最高的曲线下面积（AUC）为 0.602（图 S3J）。比例风险回归显示了这四个指标的预后价值。在单变量 Cox 回归中，这些指标对于 OS 或 PFS 均未显示出显著的预后价值，而在多变量 Cox 回归中，较高的 NLR 与较短的 OS 相关，危险比为 1.172（95% CI，1.0066–1.3639）（图 S3K 和图 S3L）。相应地，先前的报告已经显示 NLR 是胃食管交界和胃腺癌的负面预后因子。总体而言，这四个指标的预后价值有限。
术后肿瘤基质 PD-L1 水平和术前血清 PD-L1 水平均可预测术前化疗反应#
PD-L1 是关键的免疫调控分子。与其受体 PD-1 相互作用时，PD-L1 抑制细胞毒性 T 细胞的免疫反应，从而参与肿瘤免疫逃逸。Choi 等人基于 CLASSIC 试验队列报告称，基质 PD-L1 水平可以预测在第 II/III 期胃癌 D2 胃切除术后的辅助化疗效果。利用基于 PD1/PDL1 免疫组织化学染色的类似评分系统，我们发现非响应者在手术切除的肿瘤样本中基质 PD-L1 染色分数较高的趋势（图 4A 和图 4B）。基质 PD-1 染色显示了类似的趋势，尽管这在统计学上并不显著（图 S4A 和图 S4B）。然而，肿瘤区域的 PD-L1 染色与治疗反应没有相关性（图 4A）。这些结果表明肿瘤中的基质 PD-L1 水平可以预测术前化疗的反应，并表明 PD-1/PD-L1 途径可能在胃癌的化疗抵抗中起到作用。
然而，由于其延迟性，术后基质 PD-L1 的反应预测价值可能会受到较大的限制。理想的预测因子应该是术前的。术前内镜活检的基质 PD-L1 染色无法预测治疗反应（图 S4C 和图 S4D）。因此，我们进一步评估了术前血清 PD-L1 水平的临床意义。有趣的是，术前血清 PD-L1 水平在不同治疗反应的患者中显示出差异（图 4C）。在治疗前，响应者的血清 PD-L1 水平较低，而治疗似乎减弱了这种差异，因为在术后样本中未观察到显著差异（图 4E）。利用 ROC 曲线评估术前和术后血清 PD-L1 水平的治疗响应预测价值。术前血清 PD-L1 水平的 AUC 为 0.737（95% CI，0.569–0.904），而术后血清 PD-L1 水平的 AUC 约为 0.5（图 4D 和图 4F），表明术前血清 PD-L1 水平是术前化疗的有希望的治疗响应预测因子。术前血清 PD-L1 水平较高（>5.084 归一化蛋白表达 [NPX]）的患者倾向于对术前化疗显示较差的治疗反应（图 S4E）。
我们还评估了不同治疗反应患者的治疗期血清 PD-L1 水平。在响应者中，血清 PD-L1 在治疗过程中似乎有所增加。响应者的治疗期血清 PD-L1 水平显著较高（图 S4F 和图 S4G）。这种差异的一个潜在原因可能是肿瘤细胞的破坏。需要更多样本和进一步研究来确认这一发现并揭示潜在机制。进一步测量了 PD-L1/PD-1 水平与血清 PD-L1 水平之间的病理学相关性。在不同的配对中，术前血清 PD-L1 水平和术后基质 PD-1 水平显示出最强的相关性（图 S4H）。术前血清 PD-L1 水平可能与化疗后肿瘤中 PD-1 + 免疫细胞的浸润有关。
总体而言，这些结果表明，术后肿瘤基质 PD-L1 水平和术前血清 PD-L1 水平均可以预测术前化疗的反应，而术前血清 PD-L1 水平应具有更大的临床意义。
术前血清 CCL20 水平预测术前化疗的反应#
受 PD-L1 的发现启发，我们进一步比较了不同治疗反应患者的术前血清免疫蛋白质组学，结果显示 10 种蛋白质具有 p <0.05 的差异。其中，术前 CCL20 水平显示出最显著的差异。值得注意的是，我们还比较了不同治疗反应患者的术后血清免疫蛋白质组学，与术前样本相比，差异要弱得多（图 S5A）。
近期的研究已经确立了 CCL20 在不同癌症中作为化疗抵抗的重要介质。正如图 S5B 所总结的，Chen 等人报告称，化疗通过核因子 kB（NF-kB）和 CCL20 之间的正反馈环路诱导 CCL20，并通过上调乳腺癌中的 ATP 结合盒亚家族 B 成员 1（ABCB1）表达介导化疗抵抗。Wang 等人报告称，化疗通过 FOXO1/CEBPB/NF-kB 信号途径在结直肠癌细胞中上调 CCL20，而分泌的 CCL20 招募调节性 T 细胞，促进化疗抵抗。Liu 等人报告称，顺铂刺激的经典活化巨噬细胞（CAMs）通过增加 CCL20 的产生促进卵巢癌细胞迁移。总体而言，现有的研究表明，CCL20 的上调是由化疗引起的，并且增加的 CCL20 产生促进了化疗抵抗。
然而，我们的研究发现上述模型在胃癌中可能不成立。我们发现，在术前化疗的响应者中，治疗开始前血清 CCL20 水平显著较低（图 5B）。术前血清 CCL20 水平预测治疗反应，AUC 为 0.769（95% CI，0.614–0.925）（图 5C），表明胃癌患者在治疗前的血清 CCL20 水平存在差异。与现有的研究结果一致，非响应者的肿瘤中 CCL20 mRNA 水平上调（图 5D）。然而，治疗后血清 CCL20 水平在响应者和非响应者之间没有差异，表明血清和肿瘤 CCL20 水平脱钩（图 5E）。有趣的是，参考沈等人报道的可切除胃癌的血清和组织蛋白质组学，我们发现胃癌患者的血清 CCL20 水平相对于健康人有所升高（图 5F）。肿瘤样本中 CCL20 蛋白水平也较正常胃组织高（图 S5C）。然而，通过胃切除手术切除肿瘤并没有恢复血清 CCL20 水平，而是进一步增加了血清 CCL20 水平（图 5F）。这些结果表明，血清 CCL20 并不是肿瘤 CCL20 的系统反映，而是系统免疫对胃癌和化疗的重要组成部分。
我们还验证了现有研究提出的 CCL20 上调的信号模型。Kim 等人收集了在接受第一线标准化疗但未接受 PD-1 阻断的治疗前和治疗过程中胃活检样本的治疗前患者。我们分析了他们的转录组数据，并发现化疗并没有增加肿瘤样本中 CCL20 mRNA 水平。相反，化疗后 CCL20 mRNA 水平下降（图 5G）。这一发现挑战了 CCL20 在胃癌中是由化疗引起的假设。与此同时，ABCB1、CEBPB 和 FOXO1 mRNA 水平在不同反应的肿瘤之间（图 5H）以及在化疗前后活检样本之间（图 S5D）也没有差异。相反，更高的术前血清 CCL20 水平与肿瘤中 CD4+T 细胞的浸润较少相关（图 S5E）。CD4+T 细胞介导免疫应答，在实现对肿瘤的调节和有效免疫应答中至关重要。与此同时，更高的术前血清 CCL20 水平与更多基质中 PD-1 + 或 PD-L1 + 细胞的浸润相关（图 5I 和图 S5F），这应该是肿瘤免疫逃逸的关键介质。总体而言，这些结果表明，血清 CCL20 诱导了一个针对化疗的系统免疫抑制环境。
正如图 5J 所总结的，现有的研究提出，肿瘤中 CCL20 的上调是由化疗引起的，而增加的 CCL20 产生促进了化疗抵抗。然而，我们发现在化疗开始前患者的血清 CCL20 水平存在差异。术前血清 CCL20 水平较高的患者倾向于具有较差的治疗反应。潜在机制是血清 CCL20 诱导了一个系统性的免疫抑制环境。这些发现提示，在术前血清 CCL20 水平较高的患者中，免疫治疗可能与化疗的结合更为有效。已经投入了大量努力来开发 CCR6-CCL20 轴（CCR6 是 CCL20 的细胞受体）的抑制剂。通过抗体或拮抗剂干扰 CCR6-CCL20 轴在癌症治疗中显示出潜力。术前血清 CCL20 水平可能有助于选择那些有望从 CCR6-CCL20 抑制剂中受益的患者。此外，这些发现表明术前期是通过血清蛋白标志物进行患者分层的一个不可替代的时间窗口。因此，我们决定进一步建立一个用于预测术前化疗反应的术前血清蛋白组合。
一个用于预测术前化疗反应的术前血清蛋白评分系统#
通过比较不同治疗反应患者的术前血清蛋白水平（图 5A），我们将 15 个 p<0.1 的蛋白包括在一致性聚类中。基于一致性累积分布函数（CDF）图、增量面积图以及对一致性矩阵的手动检查，我们发现了四个术前血清亚型（图 6A、6B 和图 S6A–S6H）。其中，cluster 2 与患者的明显更好的治疗反应相关（图 6C）。这种无审查的聚类还与患者的临床特征相关，如肿瘤的 Lauren 分类。Cluster 1 和 4 与更高比例的腺癌肿瘤类型相关（图 6D）。
考虑到临床实用性，我们进一步使用最小绝对值收缩和选择算子（LASSO）模型建立了一个用于预测术前化疗反应的术前血清响应预测分数（PSRscore）（图 S6I 和 S6J）。简而言之，LASSO 回归是一种使用收缩进行变量选择或参数消除的线性回归类型。通过适当的 l 值，PSRscore 的公式限制为四个蛋白质的血清水平：CCL3、IL-15Ra、CXCL5 和 CCL20（图 6F 和图 S6K）。PSRscore 的 ROC 曲线，AUC 为 0.907（95% CI，0.814–1.000），确定了截断值为 - 0.843（图 6E）。患者被分为 PSRscore 高组和低组（图 6F）。低 PSRscore 与明显较差的治疗反应相关（图 6G）。此外，PSRscore 低的患者在术后肿瘤中数值上具有更多 PD1+/PD-L1 + 细胞的基质浸润和更高的肿瘤 PD-L1 染色（图 6H 和图 S6L），这通常导致对抗 PD-1/PDL1 疗法的适应症。
除了 CCL20 外，PSRscore 还包括 CCL3、IL-15Ra 和 CXCL5 的术前血清水平。较高的血清 CCL3 和 IL-15Ra 水平以及较低的 CXCL5 水平与较差的治疗反应相关（图 S6K）。研究表明，CCL3 参与了不同癌症中的免疫逃逸和化疗抵抗。高水平的 CCL3 与 Tregs、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓系源性抑制细胞（MDSCs）的肿瘤内浸润增加相关。CCL3 驱动的 TAMs 招募已被认为是转移性巢穴的驱动事件。已经开发了 CCL3 的中和抗体和抑制剂，并在抗癌治疗中显示出潜力。 目前对 IL-15Ra 和 CXCL5 在化疗抵抗中的作用了解有限，需要更多研究来探索它们在胃癌中的功能。
PSRscore 评分系统有助于分层胃腺癌患者，并筛选出那些可能不能仅通过术前化疗获益的患者。对于这组患者，我们的工作强烈暗示患者可能从免疫治疗的组合中受益，如免疫检查点抑制剂（ICIs）或 CCL3/20 中和抗体 / 抑制剂（图 6I）。可以设计前瞻性试验来验证这一策略，并需要建立一个验证队列来验证此评分系统的灵敏性和特异性。
TME 和血清免疫蛋白组学的预后价值#
我们进一步评估了 TME 和血清免疫蛋白组学的预后价值。在多变量 Cox 回归中包括了在单变量 Cox 回归中具有预测价值的所有基本临床特征以及年龄和性别（表 S2 和 S3）。显示为 OS 或 PFS 预测因子的免疫细胞与其风险比一起列在森林图中（图 S7A 和 S7B）。绘制了代表性生存预测因子的 Kaplan-Meier 曲线（图 S7C–S7F）。没有免疫细胞类型是 OS 的独立预测因子，而 CD68 + 巨噬细胞的浸润通过 log rank 测试、单变量 Cox 回归和多变量 Cox 回归证实，预测 PFS 缩短（图 S7C）。虽然不是独立的，CD68 + 巨噬细胞的浸润也通过 log rank 测试显示为 OS 的负面预后因子（图 S7D）。
显示为 OS 或 PFS 预测因子的术前和术后血清蛋白也在森林图中列出，与其风险比一起（图 7A、7B、S7G 和 S7H）。绘制了代表性生存预测因子的 Kaplan-Meier 曲线（图 7C、7D、S7I 和 S7J）。其中，高术后血清 IL-10RB 水平与显著缩短的 OS 和 PFS 均相关，通过 log rank 测试、单变量 Cox 回归和多变量 Cox 回归证实（图 7C 和 7D）。这表明术后血清 IL-10RB 水平是接受术前化疗的患者的强烈负面生存预测因子。值得注意的是，术后 IL-10RB 水平在术前化疗后显著升高，表明其可能参与术前化疗的反应（图 S1D）。关于 IL-10 信号在胃癌中的作用的研究还有限。需要更多的工作来了解 IL-10RB 在胃癌术前治疗中的作用。
讨论#
在过去的十年里，人们致力于揭示免疫在癌症中的作用。免疫疗法在胃癌治疗中取得了突破，免疫检查点抑制剂成为晚期胃或食管腺癌的一线治疗方法。然而，在胃癌围手术期治疗中，目前没有治疗方法成功挑战了化疗的主导地位。免疫被认为在患者受益于围手术期化疗中起着关键作用。现有研究重点关注肿瘤微环境中局部免疫反应，而对胃癌免疫的改善理解必须特别评估全身性免疫。我们使用血清免疫蛋白组学和经典全身性免疫炎症指标来描述全身免疫，并研究其与肿瘤微环境以及治疗反应的关联。我们发现围手术期治疗诱导了复杂的全身性免疫反应，这表现为动态的免疫蛋白组学。同时，对治疗反应更好的患者在治疗后显示出更具动态性的血清免疫蛋白组学变化。肿瘤微环境也显示与围手术期化疗的反应有关。然而，在治疗开始之前预测潜在的治疗反应将更加实际。令人兴奋的是，我们发现 PD-L1 和 CCL20 的术前血清水平是围手术期化疗反应的预测因子，与它们在免疫抑制中的已知作用一致。进一步建立了一个术前血清蛋白质组学面板用于预测反应，能够精确地筛选出可能不会单独对围手术期化疗产生反应的患者。对于这部分患者，我们相信他们将从免疫疗法和化疗的联合治疗中受益。同时，IL-10RB 的术后血清水平也被确认为胃癌患者预后的强大预测因子。
肿瘤内 PD-L1 在免疫抑制和化疗抵抗中的作用已经得到确认。然而，关于可溶性 PD-L1 的研究有限。我们的研究发现，在化疗开始之前，患者的血清 PD-L1 水平存在差异。对化疗产生反应的患者往往具有较低的血清 PD-L1 水平。需要进一步研究可溶性 PD-L1 在化疗抵抗中是否发挥作用。在 CCL20 中也发现了类似的发现，这是一种已知参与各种癌症化疗抵抗的趋化因子。我们的研究表明，在其他癌症类型中提出的 CCL20 诱导的化疗抵抗模型在胃癌中可能不成立。将 CCL20 的变化视为化疗的结果，剥夺了临床医生在治疗前对患者进行分层和干预的主动性。相反，我们的发现显示，在化疗开始之前，对化疗产生不同反应的患者在血清免疫蛋白组学上存在差异，这提前了患者分层和干预的时间窗口。在 PD-L1 和 CCL20 的启发下，我们开发了一个用于预测围手术期化疗反应的术前血清蛋白质组学面板，称为 PSRscore。通过计算四种免疫蛋白的术前血清蛋白水平，患者可以被分为两组。PSRscore 低的患者往往具有较差的治疗反应，并可能从免疫疗法的联合治疗中获益。这种评分系统在患者分层方面具有很大的临床应用潜力。值得注意的是，PSRscore 的建立基于一个接受铂类化疗的亚洲队列。这些免疫标志物在接受紫杉醇为基础的方案的非亚洲患者中的表现需要进一步验证。
我们相信血清蛋白标志物在胃癌患者术前分层中具有特殊的临床意义。几乎所有现有的胃癌分子分类都依赖于手术或内镜切除的肿瘤组织。以 TCGA 分类为最著名的例子，微卫星不稳定（MSI）型患者被证明更容易从免疫疗法中受益，而基因组稳定（GS）型患者对化疗反应较差。然而，这些分子分类在临床实践中很少使用。一个重要原因是大多数分子分类依赖于复杂的分子技术，如 qPCR、原位杂交，甚至是组学技术，这在大多数临床中是不可获得的。此外，在胃癌中，术前获取肿瘤样本依赖于胃镜活检。胃癌存在显著的肿瘤内异质性，且活检深度有限，这在很大程度上影响了活检样本的代表性。因此，在胃切除术之前确定胃癌的分子分类一直非常困难。相比之下，血清蛋白质组学涵盖了系统和肿瘤局部特征，因此具有灵敏性和信息性。在临床中，可以轻松获取血清样本，对患者造成的损害有限。像前列腺特异性抗原（PSA）或甲胎蛋白（AFP）这样的血清蛋白标志物已经几十年用于癌症的诊断和随访。各种医院都广泛提供用于测量血清蛋白的设备和培训人员。这些因素赋予了胃癌血清蛋白质组学研究在临床上巨大的意义。未来应建立胃癌的血清蛋白分类，以指导胃癌的围手术期治疗。
局限性#
研究存在一些需要注意的局限性。首先，治疗期间血清样本的数量相对较小，这限制了得出某些结论的统计能力。其次，多重免疫荧光（mIF）只测量了肿瘤微环境（TME）中的关键免疫细胞。单细胞测序可以更好地描绘 TME。第三，本研究的一些结论和建议应在接受术前化疗的患者的前瞻性队列甚至随机对照试验中进行进一步验证。在解释数据时应考虑这些局限性。
总的来说，我们对胃癌患者的全身免疫系统和肿瘤微环境进行了描述，并展示了它们与术前化疗反应的关联。我们鉴定了用于预测治疗反应和预后的血清生物标志物。这项工作强调了全身免疫在胃癌术前化疗中的基本但很大程度上被低估的作用，支持了一种基于术前血清免疫蛋白质组学的患者分层策略，并突显了在未来研究中全面描绘免疫的重要性。