導言#
胃癌，其中胃腺癌（GAC）是其主要組織學類型，是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌症相關死亡的主要原因之一。相當一部分胃癌患者在晚期被診斷，這在很大程度上限制了治療的有效性和患者的預後。儘管手術切除仍然是治療的強制性支柱，包括 JCOG9501 和 JCOG9502（日本臨床腫瘤研究組的系列研究）在內的幾項研究表明，胃癌患者不會從擴大切除中受益。在過去的十年中，新輔助和圍手術期治療帶來了新的希望。MAGIC 試驗表明，對於可切除的 II/III 期胃癌患者，行三個術前和三個術後周期的 ECF（表阿霉素、順鉑和 5 - 氟尿嘧啶）化療，相較於僅手術，可以將 5 年生存率從 23% 提高到 36%（MAGIC: the Medical Research Council Adjuvant Gastric Infusional Chemotherapy）。FLOT4-AIO 試驗進一步顯示，與 ECF 或 ECX（表阿霉素、5 - 氟尿嘧啶和卡培他滨）相比，FLOT（5 - 氟尿嘧啶、葉酸、奧沙利鉑和多西紫杉醇）方案可導致更好的病理反應率、R0 切除率和總生存（OS）。人們認識到，術前用化療治療可以增加根治切除的機會，消除早期微觀擴散，並允許對輔助治療進行術前反應評估。隨著免疫檢查點抑制劑（ICIs）等新藥物的出現，化療仍然是胃癌圍手術期治療中最基本且可獲得的組成部分。
另一方面，在胃癌中，術前治療仍然存在爭議，尤其是在東亞國家。對術前化療的反應存在異質性，而對其機制的了解有限。需要預測患者對術前化療反應的生物標誌物，以對患者進行最佳治療分層。新出現的證據表明，免疫參與了患者對化療的反應。Choi 等人報導，腫瘤標本中基質程序性細胞死亡配體 1（PD-L1）的表達可以預測第 II/III 期胃癌經 D2 胃切除術後輔助化療的益處。Kim 等人在標準一線化療期間使用配對的術前和治療期間的胃活檢樣本，發現化療誘導了自然殺傷細胞（NK）的浸潤，巨噬細胞的極化，以及在治療反應者中抗原呈遞的增加。但是，在胃癌免疫學領域的現有研究主要集中在腫瘤微環境（TME）中的局部免疫反應上，關於全身免疫與胃癌化療反應之間的關係知之甚少。
胃癌是一種全身性疾病。腫瘤負擔和抗腫瘤治療刺激的免疫反應在不同組織之間協調進行。對接受術前化療的患者進行系統免疫景觀或由 Hiam-Galvez 等人描述的免疫宏環境的分析對於全面了解癌症免疫和治療抵抗機制至關重要。現有的系統免疫 - 炎症指標，如中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR），主要依賴於血細胞計數，這限制了它們的維度。血清免疫蛋白質組學，具有高含量，將是對全身性免疫的理想反映。在這項研究中，我們收集了胃腺癌患者在術前、術中和術後接受術前化療的血清樣本，並使用基於抗體的蛋白質組學平台（Olink Target 96 Inflammation panel）研究了他們的免疫蛋白質組學。我們還從這些患者中收集了手術切除的腫瘤樣本，並結合多重免疫螢光（mIF）、免疫組織化學（IHC）和 RNA 測序（RNA-seq）來評估腫瘤微環境。研究了血清免疫蛋白質組學的動態變化及其與腫瘤微環境的相關性。鑑定了預測接受術前化療患者腫瘤縮小、總生存（OS）和無進展生存（PFS）的生物標誌物。
結果#
研究人群#
本研究納入了 90 名接受術前化療並隨後接受胃切除手術的胃腺癌患者（圖 1A）。在術前期間接受免疫檢查點抑制劑（ICIs）的患者被排除在外。符合條件的患者被分為響應者（殘餘腫瘤 / 腫瘤床≤50% 的化療效果，Becker TRG 評分 1–2）和非響應者（Becker TRG 評分 3）。在 90 名患者中，有 36 人（40%）達到了腫瘤縮小評分 1–2，被視為響應者。腫瘤縮小程度較好的患者與非響應者相比，總生存顯著更長（圖 S1A）。無進展生存顯示了類似的趨勢，儘管沒有統計學差異（圖 S1B）。患者的基本臨床特徵總結在表 S1 中。近半數的患者接受了兩藥細胞毒性化療，其中大多數是 SOX（S-1 加奧沙利鉑）或 XELOX（卡培他滨加奧沙利鉑）方案。其餘的患者接受了三藥細胞毒性化療，主要是 DOS（多西紫杉醇、奧沙利鉑和 S-1）方案。截至 2022 年 3 月 1 日的分析日期，中位隨訪時間為 55.8 個月（範圍從 3.2 到 82.7 個月）。在整體人群中，中位無進展生存為 39.8 個月（95% 置信區間 [CI]，32.7 至未達到 [NR]），而中位總生存為 63.9 個月（95% CI，51.8 至 74.1），有 45 例死亡（50%）。
血清免疫蛋白質組學動態與術前化療反應相關#
從接受術前化療的患者中收集了 37 份術前、8 份術中和 83 份術後的血清樣本，其中 30 份術前和 30 份術後的血清樣本是成對的（圖 1A）。使用 Olink Target 96 Inflammation panel 的近距離擴展測定法（PEA）測量了關鍵免疫和炎症通路中 92 個標記蛋白的水平。比較術前和術後血清樣本中蛋白質水平顯示了術前化療後血清免疫蛋白質組學的動態變化。92 個蛋白中有 18 個在成對和非成對測試中均顯示出顯著變化（圖 1B、圖 S1C 和圖 S1D），表明術前化療引發了複雜的全身免疫反應。其中，血清 C-X-C 基序化學因子配體 1（CXCL1）和 CXCL5 水平在術前化療後顯著下降（圖 S1D）。有趣的是，Zhou 等人報導，作為 CXCR2 配體的 CXCL1 和 CXCL5 可以顯著促進胃癌細胞的遷移，並推動胃癌的轉移。化療通過降低 CXCL5 和 CXCL1 的血清水平可能有助於預防胃癌的轉移。事實上，CXCL1/5 水平在術前化療的早期周期中下降（圖 S1E）。
我們進一步比較了不同治療反應患者的血清免疫蛋白質組學動態變化。我們發現，響應者在治療後表現出更動態的血清免疫蛋白質組學變化（圖 1C 和 1D）。我們還比較了化療後響應者和非響應者蛋白水平的絕對變化，發現在響應者中，免疫蛋白水平在化療後整體上更大幅度的變化（圖 1E）。例如，與響應者相比，非響應者治療後血清 CXCL5 水平的降低程度要輕得多（圖 1C–1F）。在治療期間的蛋白質組學在響應者和非響應者中也似乎存在差異（圖 S1E）。例如，在響應者中，治療期間血清白介素受體亞單位 b（IL-10RB）和 IL-18 水平在化療過程中呈上升趨勢，而在非響應者中未呈現這種趨勢（圖 S1F 和圖 S1G），儘管這一部分的結論可能受到樣本數量的限制。
綜合而言，這些結果表明在胃腺癌患者中對術前化療存在複雜的全身性免疫反應。響應者在術前化療後往往表現出更為動態的全身性免疫反應。
腫瘤微環境（TME）與患者對術前化療的反應相關#
首先，我們比較了來自不同治療反應患者的腫瘤樣本的轉錄組，以獲得有關腫瘤局部特徵的一般知識。基因集富集分析（GSEA）顯示了良好反應者中改變的標誌性通路（圖 2A）。如 DNA 複製和細胞週期等通路的改變，可能表明抑制癌細胞增殖和腫瘤退化。除此之外，近一半的通路與免疫有關，如趨化因子信號通路和細胞因子與細胞因子受體相互作用通路（圖 2B 和圖 2C），表明免疫在化療中的重要性。
因此，我們通過多重免疫螢光（mIF）在手術切除的腫瘤樣本中評估了地理免疫景觀。我們使用 CD4、CD8 和 Foxp3 染色來識別不同類型的 T 細胞。我們使用 CD68 和 CD163 染色來識別巨噬細胞（圖 2D）。我們比較了響應者和非響應者之間的免疫浸潤。CD68 + 巨噬細胞和 CD68+/CD163+ M2 巨噬細胞的細胞密度在非響應者中顯著更高（圖 2E 和圖 S2A）。相應地，Xing 等人報導，在胃癌新輔助化療後，非響應者中 CD68 + 巨噬細胞浸潤更高。M2 巨噬細胞也被證明參與了多種癌症的化療耐藥。
與此同時，我們從隊列中收集了 24 份術前內鏡活檢樣本。我們使用 mIF 對術前 TME 進行了分析（圖 S2B）。值得注意的是，大多數內鏡活檢只獲取了胃的表淺黏膜，這在很大程度上限制了它們對整個腫瘤的代表性和與手術切除組織的可比性（圖 S2C）。事實上，mIF 顯示術前 TME 中的免疫細胞浸潤在響應者和非響應者之間沒有差異（修訂後的圖 S2D），這可能是由於活檢深度有限和胃癌內腫瘤的顯著異質性。
總體而言，這些結果表明術後 TME 與對術前化療的反應相關。
血清免疫蛋白質組學與 TME 之間的相關性#
鑑於大多數現有的癌症免疫學研究集中在腫瘤微環境（TME）上，我們評估了全身免疫與 TME 之間的相關性。我們還確定了血清免疫蛋白質組學與 TME 中免疫細胞浸潤之間的相關性。有趣的是，術後 TME 似乎與術前而非術後血清免疫蛋白質組學更相關。即使在樣本數量較少的情況下，術前血清免疫蛋白質組學與免疫細胞浸潤之間的相關性總體上更強（圖 3A 和圖 3B）。例如，更高的術前血清纖維母細胞生長因子 21（FGF21）水平與 CD68 + 巨噬細胞的浸潤較少呈相關，而更高的術前血清轉化生長因子 b1（TGF-b1）水平與 CD4+T 細胞的浸潤較多呈相關（圖 3C 和圖 3D）。事實上，據報導 TGF-b 在調節效應器和調節性 CD4 陽性細胞反應方面具有多效性。術後血清免疫蛋白質組學與術後免疫細胞浸潤之間的相關性也被觀察到。例如，更高的術前血清 C-C 基序化學因子配體 11（CCL11）水平與 CD4+/FOXP3+ T 細胞的浸潤較多呈相關（圖 3E）。王等人報導 CCL11 增加了乳腺癌中 CD4+CD25+Foxp3 + 調節性 T 細胞（Tregs）的比例。需要進一步的研究來探討 CCL11 是否在胃癌中調節 CD4+Foxp3+Treg 細胞功能。
我們還評估了術後血清蛋白水平與 92 個免疫基因的腫瘤 mRNA 水平之間的相關性。其中有 5 個免疫基因的相關性具有統計學意義，僅有兩個是正相關的，符合預期（圖 3F 和圖 S3A–S3E）。TNFSF12 和 CCL4 的相關性實際上是邊緣的（圖 S3A 和圖 S3B）。血清蛋白水平與組織基因 mRNA 水平之間的相關性總體上較弱。
這些結果顯示了全身性免疫與腫瘤微環境之間的相互通信和相互依賴關係。對腫瘤微環境的研究無法充分揭示免疫系統如何全面應對胃癌和抗腫瘤治療。應該投入更多的努力來對患有胃癌的患者進行系統性免疫分析。
經典全身性免疫炎症指標的臨床價值#
經典全身性免疫炎症指標大多基於血細胞比率，並已證明與患者的臨床結局相關。我們對血清免疫蛋白質組學與經典全身性免疫炎症指標之間的關係感到好奇。因此，我們評估了術後血清免疫蛋白質組學與經典免疫炎症指標之間的相關性，包括中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）、血小板與淋巴細胞比值（PLR）、單核細胞與淋巴細胞比值（MLR）以及血小板分布寬度（PDW）以及常見血細胞計數。儘管大多數相關性相對較弱（圖 S3F），但血清 CXCL5 和 CXCL1 水平與血小板計數呈強相關（圖 S3G 和圖 S3H）。由於 CXCL1 和 CXCL5 通常參與中性粒細胞的穩態和功能，需要更多的工作來理解這種意外但有趣的相關性。我們還評估了經典全身性免疫炎症指標與 TME 特徵之間的關係。術後經典免疫炎症指標與 TME 中的免疫細胞浸潤之間沒有觀察到相關性（圖 S3I）。
我們進一步探討了經典全身性免疫炎症指標的臨床價值，並評估了中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）、血小板與淋巴細胞比值（PLR）、單核細胞與淋巴細胞比值（MLR）和血小板分布寬度（PDW）的治療響應預測價值。我們繪製了這四個指標的受試者工作特徵（ROC）曲線，最高的曲線下面積（AUC）為 0.602（圖 S3J）。比例風險回歸顯示了這四個指標的預後價值。在單變量 Cox 回歸中，這些指標對於 OS 或 PFS 均未顯示出顯著的預後價值，而在多變量 Cox 回歸中，較高的 NLR 與較短的 OS 相關，危險比為 1.172（95% CI，1.0066–1.3639）（圖 S3K 和圖 S3L）。相應地，先前的報告已經顯示 NLR 是胃食管交界和胃腺癌的負面預後因子。總體而言，這四個指標的預後價值有限。
術後腫瘤基質 PD-L1 水平和術前血清 PD-L1 水平均可預測術前化療反應#
PD-L1 是關鍵的免疫調控分子。與其受體 PD-1 相互作用時，PD-L1 抑制細胞毒性 T 細胞的免疫反應，從而參與腫瘤免疫逃逸。Choi 等人基於 CLASSIC 試驗隊列報告稱，基質 PD-L1 水平可以預測在第 II/III 期胃癌 D2 胃切除術後的輔助化療效果。利用基於 PD1/PDL1 免疫組織化學染色的類似評分系統，我們發現非響應者在手術切除的腫瘤樣本中基質 PD-L1 染色分數較高的趨勢（圖 4A 和圖 4B）。基質 PD-1 染色顯示了類似的趨勢，儘管這在統計學上並不顯著（圖 S4A 和圖 S4B）。然而，腫瘤區域的 PD-L1 染色與治療反應沒有相關性（圖 4A）。這些結果表明腫瘤中的基質 PD-L1 水平可以預測術前化療的反應，並表明 PD-1/PD-L1 途徑可能在胃癌的化療抵抗中起到作用。
然而，由於其延遲性，術後基質 PD-L1 的反應預測價值可能會受到較大的限制。理想的預測因子應該是術前的。術前內鏡活檢的基質 PD-L1 染色無法預測治療反應（圖 S4C 和圖 S4D）。因此，我們進一步評估了術前血清 PD-L1 水平的臨床意義。有趣的是，術前血清 PD-L1 水平在不同治療反應的患者中顯示出差異（圖 4C）。在治療前，響應者的血清 PD-L1 水平較低，而治療似乎減弱了這種差異，因為在術後樣本中未觀察到顯著差異（圖 4E）。利用 ROC 曲線評估術前和術後血清 PD-L1 水平的治療響應預測價值。術前血清 PD-L1 水平的 AUC 為 0.737（95% CI，0.569–0.904），而術後血清 PD-L1 水平的 AUC 約為 0.5（圖 4D 和圖 4F），表明術前血清 PD-L1 水平是術前化療的有希望的治療響應預測因子。術前血清 PD-L1 水平較高（>5.084 歸一化蛋白表達 [NPX]）的患者傾向於對術前化療顯示較差的治療反應（圖 S4E）。
我們還評估了不同治療反應患者的治療期血清 PD-L1 水平。在響應者中，血清 PD-L1 在治療過程中似乎有所增加。響應者的治療期血清 PD-L1 水平顯著較高（圖 S4F 和圖 S4G）。這種差異的潛在原因可能是腫瘤細胞的破壞。需要更多樣本和進一步研究來確認這一發現並揭示潛在機制。進一步測量了 PD-L1/PD-1 水平與血清 PD-L1 水平之間的病理學相關性。在不同的配對中，術前血清 PD-L1 水平和術後基質 PD-1 水平顯示出最強的相關性（圖 S4H）。術前血清 PD-L1 水平可能與化療後腫瘤中 PD-1 + 免疫細胞的浸潤有關。
總體而言，這些結果表明，術後腫瘤基質 PD-L1 水平和術前血清 PD-L1 水平均可以預測術前化療的反應，而術前血清 PD-L1 水平應具有更大的臨床意義。
術前血清 CCL20 水平預測術前化療的反應#
受 PD-L1 的發現啟發，我們進一步比較了不同治療反應患者的術前血清免疫蛋白質組學，結果顯示 10 種蛋白質具有 p <0.05 的差異。其中，術前 CCL20 水平顯示出最顯著的差異。值得注意的是，我們還比較了不同治療反應患者的術後血清免疫蛋白質組學，與術前樣本相比，差異要弱得多（圖 S5A）。
近期的研究已經確立了 CCL20 在不同癌症中作為化療抵抗的重要介質。正如圖 S5B 所總結的，Chen 等人報導稱，化療通過核因子 kB（NF-kB）和 CCL20 之間的正反饋環路誘導 CCL20，並通過上調乳腺癌中的 ATP 結合盒亞家族 B 成員 1（ABCB1）表達介導化療抵抗。Wang 等人報導稱，化療通過 FOXO1/CEBPB/NF-kB 信號途徑在結直腸癌細胞中上調 CCL20，而分泌的 CCL20 招募調節性 T 細胞，促進化療抵抗。Liu 等人報導稱，順鉑刺激的經典活化巨噬細胞（CAMs）通過增加 CCL20 的產生促進卵巢癌細胞遷移。總體而言，現有的研究表明，CCL20 的上調是由化療引起的，並且增加的 CCL20 產生促進了化療抵抗。
然而，我們的研究發現上述模型在胃癌中可能不成立。我們發現，在術前化療的響應者中，治療開始前血清 CCL20 水平顯著較低（圖 5B）。術前血清 CCL20 水平預測治療反應，AUC 為 0.769（95% CI，0.614–0.925）（圖 5C），表明胃癌患者在治療前的血清 CCL20 水平存在差異。與現有的研究結果一致，非響應者的腫瘤中 CCL20 mRNA 水平上調（圖 5D）。然而，治療後血清 CCL20 水平在響應者和非響應者之間沒有差異，表明血清和腫瘤 CCL20 水平脫鉤（圖 5E）。有趣的是，參考沈等人報導的可切除胃癌的血清和組織蛋白質組學，我們發現胃癌患者的血清 CCL20 水平相對於健康人有所升高（圖 5F）。腫瘤樣本中 CCL20 蛋白水平也較正常胃組織高（圖 S5C）。然而，通過胃切除手術切除腫瘤並沒有恢復血清 CCL20 水平，而是進一步增加了血清 CCL20 水平（圖 5F）。這些結果表明，血清 CCL20 並不是腫瘤 CCL20 的系統反映，而是系統免疫對胃癌和化療的重要組成部分。
我們還驗證了現有研究提出的 CCL20 上調的信號模型。Kim 等人收集了在接受第一線標準化療但未接受 PD-1 阻斷的治療前和治療過程中胃活檢樣本的治療前患者。我們分析了他們的轉錄組數據，並發現化療並沒有增加腫瘤樣本中 CCL20 mRNA 水平。相反，化療後 CCL20 mRNA 水平下降（圖 5G）。這一發現挑戰了 CCL20 在胃癌中是由化療引起的假設。與此同時，ABCB1、CEBPB 和 FOXO1 mRNA 水平在不同反應的腫瘤之間（圖 5H）以及在化療前後活檢樣本之間（圖 S5D）也沒有差異。相反，更高的術前血清 CCL20 水平與腫瘤中 CD4+T 細胞的浸潤較少相關（圖 S5E）。CD4+T 細胞介導免疫應答，在實現對腫瘤的調節和有效免疫應答中至關重要。與此同時，更高的術前血清 CCL20 水平與更多基質中 PD-1 + 或 PD-L1 + 細胞的浸潤相關（圖 5I 和圖 S5F），這應該是腫瘤免疫逃逸的關鍵介質。總體而言，這些結果表明，血清 CCL20 誘導了一個針對化療的系統免疫抑制環境。
正如圖 5J 所總結的，現有的研究提出，腫瘤中 CCL20 的上調是由化療引起的，而增加的 CCL20 產生促進了化療抵抗。然而，我們發現在化療開始前患者的血清 CCL20 水平存在差異。術前血清 CCL20 水平較高的患者傾向於具有較差的治療反應。潛在機制是血清 CCL20 誘導了一個系統性的免疫抑制環境。這些發現提示，在術前血清 CCL20 水平較高的患者中，免疫治療可能與化療的結合更為有效。已經投入了大量努力來開發 CCR6-CCL20 軸（CCR6 是 CCL20 的細胞受體）的抑制劑。通過抗體或拮抗劑干擾 CCR6-CCL20 軸在癌症治療中顯示出潛力。術前血清 CCL20 水平可能有助於選擇那些有望從 CCR6-CCL20 抑制劑中受益的患者。此外，這些發現表明術前期是通過血清蛋白標誌物進行患者分層的一個不可替代的時間窗口。因此，我們決定進一步建立一個用於預測術前化療反應的術前血清蛋白組合。
一個用於預測術前化療反應的術前血清蛋白評分系統#
通過比較不同治療反應患者的術前血清蛋白水平（圖 5A），我們將 15 個 p<0.1 的蛋白包括在一致性聚類中。基於一致性累積分布函數（CDF）圖、增量面積圖以及對一致性矩陣的手動檢查，我們發現了四個術前血清亞型（圖 6A、6B 和圖 S6A–S6H）。其中，cluster 2 與患者的明顯更好的治療反應相關（圖 6C）。這種無審查的聚類還與患者的臨床特徵相關，如腫瘤的 Lauren 分類。Cluster 1 和 4 與更高比例的腺癌腫瘤類型相關（圖 6D）。
考慮到臨床實用性，我們進一步使用最小絕對值收縮和選擇算子（LASSO）模型建立了一個用於預測術前化療反應的術前血清響應預測分數（PSRscore）（圖 S6I 和 S6J）。簡而言之，LASSO 回歸是一種使用收縮進行變量選擇或參數消除的線性回歸類型。通過適當的 l 值，PSRscore 的公式限制為四個蛋白質的血清水平：CCL3、IL-15Ra、CXCL5 和 CCL20（圖 6F 和圖 S6K）。PSRscore 的 ROC 曲線，AUC 為 0.907（95% CI，0.814–1.000），確定了截斷值為 - 0.843（圖 6E）。患者被分為 PSRscore 高組和低組（圖 6F）。低 PSRscore 與明顯較差的治療反應相關（圖 6G）。此外，PSRscore 低的患者在術後腫瘤中數值上具有更多 PD1+/PD-L1 + 細胞的基質浸潤和更高的腫瘤 PD-L1 染色（圖 6H 和圖 S6L），這通常導致對抗 PD-1/PDL1 療法的適應症。
除了 CCL20 外，PSRscore 還包括 CCL3、IL-15Ra 和 CXCL5 的術前血清水平。較高的血清 CCL3 和 IL-15Ra 水平以及較低的 CXCL5 水平與較差的治療反應相關（圖 S6K）。研究表明，CCL3 參與了不同癌症中的免疫逃逸和化療抵抗。高水平的 CCL3 與 Tregs、腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和髓系源性抑制細胞（MDSCs）的腫瘤內浸潤增加相關。CCL3 驅動的 TAMs 招募已被認為是轉移性巢穴的驅動事件。已經開發了 CCL3 的中和抗體和抑制劑，並在抗癌治療中顯示出潛力。目前對 IL-15Ra 和 CXCL5 在化療抵抗中的作用了解有限，需要更多研究來探索它們在胃癌中的功能。
PSRscore 評分系統有助於分層胃腺癌患者，並篩選出那些可能不能僅通過術前化療獲益的患者。對於這組患者，我們的工作強烈暗示患者可能從免疫治療的組合中受益，如免疫檢查點抑制劑（ICIs）或 CCL3/20 中和抗體 / 抑制劑（圖 6I）。可以設計前瞻性試驗來驗證這一策略，並需要建立一個驗證隊列來驗證此評分系統的靈敏性和特異性。
TME 和血清免疫蛋白組學的預後價值#
我們進一步評估了 TME 和血清免疫蛋白組學的預後價值。在多變量 Cox 回歸中包括了在單變量 Cox 回歸中具有預測價值的所有基本臨床特徵以及年齡和性別（表 S2 和 S3）。顯示為 OS 或 PFS 預測因子的免疫細胞與其風險比一起列在森林圖中（圖 S7A 和 S7B）。繪製了代表性生存預測因子的 Kaplan-Meier 曲線（圖 S7C–S7F）。沒有免疫細胞類型是 OS 的獨立預測因子，而 CD68 + 巨噬細胞的浸潤通過 log rank 測試、單變量 Cox 回歸和多變量 Cox 回歸證實，預測 PFS 縮短（圖 S7C）。雖然不是獨立的，CD68 + 巨噬細胞的浸潤也通過 log rank 測試顯示為 OS 的負面預後因子（圖 S7D）。
顯示為 OS 或 PFS 預測因子的術前和術後血清蛋白也在森林圖中列出，與其風險比一起（圖 7A、7B、S7G 和 S7H）。繪製了代表性生存預測因子的 Kaplan-Meier 曲線（圖 7C、7D、S7I 和 S7J）。其中，高術後血清 IL-10RB 水平與顯著縮短的 OS 和 PFS 均相關，通過 log rank 測試、單變量 Cox 回歸和多變量 Cox 回歸證實（圖 7C 和 7D）。這表明術後血清 IL-10RB 水平是接受術前化療的患者的強烈負面生存預測因子。值得注意的是，術後 IL-10RB 水平在術前化療後顯著升高，表明其可能參與術前化療的反應（圖 S1D）。關於 IL-10 信號在胃癌中的作用的研究還有限。需要更多的工作來了解 IL-10RB 在胃癌術前治療中的作用。
討論#
在過去的十年裡，人們致力於揭示免疫在癌症中的作用。免疫療法在胃癌治療中取得了突破，免疫檢查點抑制劑成為晚期胃或食管腺癌的一線治療方法。然而，在胃癌圍手術期治療中，目前沒有治療方法成功挑戰了化療的主導地位。免疫被認為在患者受益於圍手術期化療中起着關鍵作用。現有研究重點關注腫瘤微環境中局部免疫反應，而對胃癌免疫的改善理解必須特別評估全身性免疫。我們使用血清免疫蛋白組學和經典全身性免疫炎症指標來描述全身免疫，並研究其與腫瘤微環境以及治療反應的關聯。我們發現圍手術期治療誘導了複雜的全身性免疫反應，這表現為動態的免疫蛋白組學。同時，對治療反應更好的患者在治療後顯示出更具動態性的血清免疫蛋白組學變化。腫瘤微環境也顯示與圍手術期化療的反應有關。然而，在治療開始之前預測潛在的治療反應將更加實際。令人興奮的是，我們發現 PD-L1 和 CCL20 的術前血清水平是圍手術期化療反應的預測因子，與它們在免疫抑制中的已知作用一致。進一步建立了一個術前血清蛋白質組學面板用於預測反應，能夠精確地篩選出可能不會單獨對圍手術期化療產生反應的患者。對於這部分患者，我們相信他們將從免疫療法和化療的聯合治療中受益。同時，IL-10RB 的術後血清水平也被確定為胃癌患者預後的強大預測因子。
腫瘤內 PD-L1 在免疫抑制和化療抵抗中的作用已經得到確認。然而，關於可溶性 PD-L1 的研究有限。我們的研究發現，在化療開始之前，患者的血清 PD-L1 水平存在差異。對化療產生反應的患者往往具有較低的血清 PD-L1 水平。需要進一步研究可溶性 PD-L1 在化療抵抗中是否發揮作用。在 CCL20 中也發現了類似的發現，這是一種已知參與各種癌症化療抵抗的趨化因子。我們的研究表明，在其他癌症類型中提出的 CCL20 誘導的化療抵抗模型在胃癌中可能不成立。將 CCL20 的變化視為化療的結果，剝奪了臨床醫生在治療前對患者進行分層和干預的主動性。相反，我們的發現顯示，在化療開始之前，對化療產生不同反應的患者在血清免疫蛋白組學上存在差異，這提前了患者分層和干預的時間窗口。在 PD-L1 和 CCL20 的啟發下，我們開發了一個用於預測圍手術期化療反應的術前血清蛋白質組學面板，稱為 PSRscore。通過計算四種免疫蛋白的術前血清蛋白水平，患者可以被分為兩組。PSRscore 低的患者往往具有較差的治療反應，並可能從免疫療法的聯合治療中獲益。這種評分系統在患者分層方面具有很大的臨床應用潛力。值得注意的是，PSRscore 的建立基於一個接受鉑類化療的亞洲隊列。這些免疫標誌物在接受紫杉醇為基礎的方案的非亞洲患者中的表現需要進一步驗證。
我們相信血清蛋白標誌物在胃癌患者術前分層中具有特殊的臨床意義。幾乎所有現有的胃癌分子分類都依賴於手術或內鏡切除的腫瘤組織。以 TCGA 分類為最著名的例子，微衛星不穩定（MSI）型患者被證明更容易從免疫療法中受益，而基因組穩定（GS）型患者對化療反應較差。然而，這些分子分類在臨床實踐中很少使用。一個重要原因是大多數分子分類依賴於複雜的分子技術，如 qPCR、原位雜交，甚至是組學技術，這在大多數臨床中是不可獲得的。此外，在胃癌中，術前獲取腫瘤樣本依賴於胃鏡活檢。胃癌存在顯著的腫瘤內異質性，且活檢深度有限，這在很大程度上影響了活檢樣本的代表性。因此，在胃切除術之前確定胃癌的分子分類一直非常困難。相比之下，血清蛋白質組學涵蓋了系統和腫瘤局部特徵，因此具有靈敏性和信息性。在臨床中，可以輕鬆獲取血清樣本，對患者造成的損害有限。像前列腺特異性抗原（PSA）或甲胎蛋白（AFP）這樣的血清蛋白標誌物已經幾十年用於癌症的診斷和隨訪。各種醫院都廣泛提供用於測量血清蛋白的設備和培訓人員。這些因素賦予了胃癌血清蛋白質組學研究在臨床上巨大的意義。未來應建立胃癌的血清蛋白分類，以指導胃癌的圍手術期治療。
局限性#
研究存在一些需要注意的局限性。首先，治療期間血清樣本的數量相對較小，這限制了得出某些結論的統計能力。其次，多重免疫螢光（mIF）只測量了腫瘤微環境（TME）中的關鍵免疫細胞。單細胞測序可以更好地描繪 TME。第三，本研究的一些結論和建議應在接受術前化療的患者的前瞻性隊列甚至隨機對照試驗中進行進一步驗證。在解釋數據時應考慮這些局限性。
總的來說，我們對胃癌患者的全身免疫系統和腫瘤微環境進行了描述，並展示了它們與術前化療反應的關聯。我們鑑定了用於預測治療反應和預後的血清生物標誌物。這項工作強調了全身免疫在胃癌術前化療中的基本但很大程度上被低估的作用，支持了一種基於術前血清免疫蛋白質組學的患者分層策略，並突顯了在未來研究中全面描繪免疫的重要性。